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    上海信帆生物代理销售TUNEL细胞凋亡检测试剂盒,现货供应,,欢迎大家。

    提供者:上海信帆生物科研所   发布时间:2018/8/28  阅读次数:239次   进入该公司展台

    上海信帆生物代理销售TUNEL细胞凋亡检测试剂盒,现货供应,,欢迎大家。



    产品说明

    细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bpDNA ladder 

    TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling)细胞凋亡检测试剂盒(FITC)可以用来检测组织细胞在凋亡晚期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是在末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的作用下,在基因组DNA断裂时暴露出的3´-羟基(3´-OH)末端掺入FITC-12-dUTP,从而可以用荧光显微镜或流式细胞仪检测。

    本试剂盒?#21592;?#35760;反应进行了优化,采用zui比例的FITC-12-dUTP和未标记dNTP进行3’-OH末?#35828;?#26680;苷酸掺入,使得同一个断裂的DNA片?#25991;?#31471;可以形成更长的标记尾巴。该标记尾巴减少了相邻掺入dNTP上标记基团的空间位阻,增加每个断裂片段上的荧光基团数目,降低荧光基团相邻后可能造成的聚集和淬灭,从而提高检测灵敏度,减少非特异性反应。

    本试剂盒应用?#27573;?#24191;,可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况,也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。





    注意事项

    1)需?#21592;?#29992;于洗涤细胞的PBS,用于封片的抗荧光淬灭封片?#28023;?#29992;于固定的4%多聚甲醛。

    2)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


    操作步骤

    一、样品准备

    A. 石蜡包埋组织切片

    1)室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5min,重复一次,以彻底脱掉石蜡。

    2)室温下用100%乙醇浸泡切片5min,重复一次。

    3)室温下用梯度乙醇(908070%)各浸洗1次,每次3min

    4)用PBS轻轻润洗切片,并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时,可用石蜡笔或疏水?#35797;?#26679;品周围描绘样品分布的轮廓,便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中,切勿让样品干燥,处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

    5 配制Proteinase K工作?#28023;?#25353;1:100的比例,用PBS作为稀释液来稀释2mg/mlProteinase K溶?#28023;?#20351;其终浓度为20μg/ml

    6)每个样本上滴加100μl上述Proteinase K工作?#28023;?#20351;其被全部覆盖,室温孵育20min

    【注】:Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通?#28014;?#23413;育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤?#20889;?#36733;波片上脱落的风险,过短则可能造成透性处理不充分,影响标?#20999;?#29575;。未得到更好的结果,可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

    7)用PBS溶液润洗样本,轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本的湿润。

    B. 组织冰冻切片

    1)将玻片浸没在4%多聚甲醛溶?#28023;?#28342;于PBS)中固定,室温下孵育15min

    2)轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。

    3)将玻片浸没在PBS溶液中,室温孵育15min

    4)轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时,可用石蜡笔或疏水?#35797;?#26679;品周围描绘样品分布的轮廓,便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中,切勿让样品干燥,处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

    5 配制Proteinase K工作?#28023;?#25353;1:100的比例,用PBS作为稀释液来稀释2mg/mlProteinase K溶?#28023;?#20351;其终浓度为20μg/ml

    6)每个样本上滴加100μl上述Proteinase K工作?#28023;?#20351;其被全部覆盖,室温孵育10min

    【注】:Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通?#28014;?#23413;育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤?#20889;?#36733;波片上脱落的风险,过短则可能造成透性处理不充分,影响标?#20999;?#29575;。未得到更好的结果,可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

    7)用PBS溶液润洗样本2-3次。

    8)轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本的湿润。

    C. 细胞爬片的准备

    Lab-Tek载玻片小室(Chamber Slides)上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后,用PBS2遍载玻片。

    D. 细胞?#31185;?#30340;制备

    1)准备多聚赖氨酸包被的载玻片:吸取50–100 μl 0.01% (w/v)多聚赖氨酸水溶?#28023;?#28404;至每一片预清洗过的玻璃载玻片的表面。在将要用于固定细胞的区域将多聚赖氨酸溶?#21644;可?#20026;一薄层。待载玻片晾干之后,迅速用去离子水漂洗,然后让包被后的载玻片在空气中晾干30-60 min。包被后的载玻片能在室温储存数月。

    2)以约2×107个细胞/ml的浓度将细胞重悬于PBS中,吸取50-100μl细胞悬液滴于多聚赖氨酸包被的载玻片上,用一片干净的载玻片轻柔的涂开细胞悬液。

    3)固定细胞,将载玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中,在4℃放置25min

    4)洗涤载玻片,将其浸入PBS中,室温放置5min。重复用PBS洗一次。

    5)轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体。这时,可用石蜡笔或指甲油在样品周围描绘样品分布的轮廓,便于下游透性处理和平衡标记操作。在实验过程中,切勿让样品干燥,处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

    6 配制Proteinase K工作?#28023;?#25353;1:100的比例,用PBS作为稀释液来稀释2mg/mlProteinase K溶?#28023;?#20351;其终浓度为20μg/ml

    7)每个样本上滴加100μl上述Proteinase K溶?#28023;?#20351;其被全部覆盖,室温孵育5min(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中,室温孵育5min进?#22411;ㄍ复?#29702;)。

    【注】:Proteinase K帮助组织和细胞对后续步骤的染色试剂通?#28014;?#23413;育时间过长会增加组织切片在后续洗涤步骤?#20889;?#36733;波片上脱落的风险,过短则可能造成透性处理不充分,影响标?#20999;?#29575;。未得到更好的结果,可能需要优化Proteinase K孵育的时间。

    8)在盛有PBS溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次。

    9)轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保存样本的湿润。


    三、标记与检测

    1)按1:5的比例用去离子水稀释5×Equilibration Buffer

    2)每个样本滴加100μl 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域,室温孵育10-30分钟。或者将载玻片放入一个含有1×Equilibration Buffer的缸中,保证缓冲液没过样本。在平衡细胞的同时在冰上解冻FITC-12-dUTP Labling Mix,并?#20057;?#29031;表1,准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。对于面积小于5cm2的一个标准反应,其体积是50μl,用50μl乘以实验?#33073;?#24615;对照反应的数目来?#33539;?#25152;需TdT孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本,可成比例的增大试剂体积。

    1. 准备用于实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液

    组分

    体积(μl/50μl体系)

    ddH2O

    34

    5×Equilibration Buffer

    10

    FITC-12-dUTP Labling Mix

    5

    Recombinant TdT Enzyme

    1

    阴性对照体系:准备一份不含TdT酶的对照孵育缓冲?#28023;?#29992;ddH2O替代TdT酶。

    3)在平衡后的区域周围用吸水纸洗掉100μl 1×Equilibration Buffer中的大部分,然后在5cm2面积的细胞上加入50μl TdT孵育缓冲液。不要让细胞干掉。这之后的操作,载玻片要避光。

    4)把塑?#32454;?#29627;片盖在细胞上?#21592;?#35777;试剂的平均分布,在湿盒的底部放上用水浸湿的纸巾。将载玻片置于湿盒内,在37℃孵育60min。将湿盒用铝箔纸包裹?#21592;?#20809;。

    【注】:塑?#32454;?#29627;片在使用前可以切成两半。折起盖玻片的边缘?#21592;?#20110;移除和操作。

    5)移除塑?#32454;?#29627;片,并将切片置于PBS溶液中室温孵育5min

    6)轻轻去掉多余液体,换用新鲜的PBS溶液室温孵育5 min,重复一次。

    7 用滤纸轻轻擦掉样本周围?#27688;?#38754;的PBS溶液。注意:为了降低背景,载玻片在用PBS洗一遍后,可再用含0.1% Triton X-1005mg/ml BSAPBS3次,每次5min,这样可将游离的未反应标记物清除干净。

    8 样本在染色缸中染色,在黑暗中将载玻片浸入装有PI溶?#28023;?/span>1μg/ml,用PBS新鲜配制并稀释)的染色缸,室温放置5min。可选操作:样本在染色缸中染色,在黑暗中将载玻片浸入装有DAPI溶?#28023;?/span>2μg/ml,用PBS新鲜配制并稀释)的染色缸,室温放置5min

    9)洗涤样本,将载玻片浸入去离子水中,室温放置5min,重复2次,总共洗3次。

    10)叩干载玻片上多余的水并且用吸水纸擦拭细胞周边的区域。

    11)立即在荧光显微镜下分析样本,用标准的荧光过滤装置在520±20nm的荧光下观察绿色荧光;在620nm下观察PI的红色荧光,或在460nm观察蓝色的DAPI。如有必要,载玻片能在4℃黑暗条件下存放过夜。PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色,只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。

    四、利用流式细胞术检测悬浮细胞

    1)将3-106个细胞用PBS4℃离心(300×g)洗两次,然后重悬在0.5ml PBS中。

    2)固定细胞,加入5ml 1%配制于PBS中的多聚甲醛溶?#28023;?#20912;上放置20min

    3)细胞在4300×g离心10min,去上清并且重悬于5ml PBS。重复洗一次,并用0.5 ml PBS重悬细胞。

    4)通透细胞,加入5ml冰上预冷的70%乙醇,在-20℃孵育4小时。细胞能在70%乙醇中-20℃条件下保存一周,或者,细胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶?#21644;?#36879;,室温放置5min

    5)细胞在300×g离心10min,并用5 ml PBS重悬。重复离心,并1ml PBS重悬。

    6)转移2×106个细胞至一个1.5ml的微量离心管。

    7300×g离心10min,去上清,并用80μl 1×Equilibration Buffer重悬。室温孵育5min

    8)在平衡细胞的同时,在冰上融解FITC-12-dUTP标记混合物,并?#20057;?#29031;表1,准备足够量的用于所有反应的TdT孵育缓冲液。对于2×106个细胞的一个标准反应,其体积是50μl,用50μl乘上反应数目来?#33539;?#25152;需TdT孵育缓冲液的总体积。

    9)细胞在300×g离心10min,去上清并把沉淀重悬在50μl TdT孵育缓冲液中,37℃孵育60min,避光。每隔15min用微量移液器轻轻重悬细胞。

    10)加入1ml 20mM EDTA终止反应,用微量移液器轻柔混?#21462;?/span>

    11300×g离心10min,去上清并把沉淀重悬在1ml配制于PBS中的0.1% Triton X-100溶?#28023;?#20854;中含5mg/ml BSA,重复一次,总共洗2次。

    12300×g离心10min,去上清并把细胞沉淀重悬在0.5ml PI溶?#28023;?/span>5μg/ml)中,其中包含250μg DNA酶的Rnase A

    13)在黑暗中室温孵育细胞30min

    14)用流式细胞仪分析细胞,测量520±20nmFITC-12-dUTP的绿色荧光和>620nmPI红色荧光。PI将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色,只在凋亡细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。


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